Vladimír Viktorovič Chub,
Doktor biologických věd, profesor katedry fyziologie rostlin Biologické fakulty Moskevské státní univerzity pojmenované po M. V. Lomonosov
“Potenciál. Chemie. Biologie. Medicína“ č. 11, 12, 2011; č. 1, 2 2012

  • GMO rostliny: jak se to dělá
  • GMO rostliny: praktické aplikace
  • GMO rostliny: projekty v budoucnosti

GMO rostliny: jak se to dělá

Pravděpodobně každý z vás slyšel o hrozné, nevyléčitelné nemoci – rakovině – která může postihnout mnoho orgánů u lidí a zvířat. A vyvstává otázka: mohou rostliny dostat rakovinu?

Z předchozího článku jste se dozvěděli o kalusu – neuspořádané rostoucí mase rostlinných buněk, která se často přirozeně vyskytuje v místech poškození („Potenciál“, č. 10, str. 23).

Dostávají rostliny rakovinu?

Růst kalusu připomíná růst nádorů u zvířat. Ale naštěstí pro rostliny závisí buněčné dělení v nich vždy na dvou hormonech: auxinech a cytokininech. K zastavení růstu kalusu stačí omezit přísun alespoň jednoho z nich (buňky kalusu samy zpravidla nejsou schopny tyto látky tvořit). Jak si však pamatujete, mnoho rostlinných škůdců a patogenů syntetizuje buď auxiny, nebo cytokininy (ve vzácných případech obojí), aby kontrolovali růst rostlinných buněk. Poté se na těle rostliny tvoří „čarodějnická košťata“, hálky a další bolestivé výrůstky. Ale jakmile je patogen tak či onak zničen, bolestivý růst se okamžitě zastaví. Kalus ani hálky tedy nejsou zhoubnými nádory.

Rostliny však dostávají rakovinu. Je způsobena bakteriemi z čeledi Rhizobium (Rhizobiacae), které patří do rodu Agrobacterium (Agrobacterium). V místě infekce se vytvoří neuspořádaná dělící se hmota buněk podobná kalusu (obr. 1). Pokud je agrobakterium zabito antibiotiky, nádor bude dále růst. Objeví se zhoubný nádor, jehož růst rostlina nezvládne.

Obr. 1. Crown gall je maligní nádor způsobený Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) na větvi šeříku. Obrázek: „Potenciál. Chemie. Biologie. Lék”

Při analýze obsahu hormonů v nádoru se ukazuje, že hladina auxinů i cytokininů je zvýšená. Každá nádorová buňka je schopna produkovat tyto hormony nezávisle a již není závislá na zbytku rostlinného těla.

Agrobacteria – přírodní „genetičtí inženýři“

Agrobacterium postihuje především dvouděložné rostliny, mezi nimiž jsou nejnápadnější nádory na stromech a keřích. Agrobakterie způsobují rakovinu kořenů hroznů (původcem je A. vitis, Agrobacterium “hroznové víno”), kořeny maliníku (A. rubi, Agrobacterium “malina”), onemocnění žlučníku u širokého spektra hostitelů (A. tumefaciens, agrobacterium „tvořící nádory“). Neobvyklou chorobu, která se jeví jako masu kořenů hustě pokrytých kořenovými vlásky, střapatou nebo vousatou kořenovou chorobu, je také způsobena Agrobacterium (A. rhizogenes, Agrobacterium „nativní“). Mezi agrobakteriemi existuje i relativně „mírumilovný“ (nepatogenní) druh – A. radiobacter (agrobacterium “kořen”), který žije v tenké vrstvě půdy obklopující kořeny rostlin. A. radiobacter živí se kořenovými sekrety, ale nezpůsobuje poškození samotných rostlin. Co způsobuje infekční vlastnosti většiny typů agrobakterií?

ČTĚTE VÍCE
Jaká zvířata žijí v regionu Penza?

Genetický materiál bakterií se skládá z nukleoid (velká kruhová molekula DNA, která uchovává „základní“ genetickou informaci) a plazmidy (menší kruhové molekuly DNA s menší informační kapacitou). Schopnost agrobakterií infikovat určité druhy rostlin je „naprogramována“ přesně v plazmidech. V závislosti na typu onemocnění se tyto plazmidy označují jako Ti-plazmidy (z angl. vyvolávající nádor – nádory způsobující) a Ri-plazmidy (z angl. kořenová indukce – způsobující [huňaté] kořeny). Když jsou plazmidy ztraceny, Agrobacteria ztrácejí schopnost způsobovat odpovídající onemocnění.

Plazmidy mají řadu zajímavých a prakticky důležitých vlastností. Za prvé, nejen Ti- a Ri-plazmidy, ale dokonce dva různé Ti-plazmidy se nemohou vyskytovat v jedné buňce Agrobacterium! První plazmid, který se „usadí“ v bakteriích, nějakým způsobem brání pronikání a reprodukci dalších jemu podobných plazmidů.

Za druhé, plazmidy jsou schopné přenosu z jedné bakteriální buňky do druhé. Paradoxně je v půdě pouze 1–5 % volně žijících buněk agrobakterií „vyzbrojeno“ plazmidy Ti nebo Ri. Ale jakmile začne proces infekce, plazmidy se aktivně množí a přenášejí se z bakterií na bakterie.

Za třetí, Ti- a Ri-plazmidy (ve srovnání s jinými bakteriálními plazmidy) jsou velké velikosti: asi 200–300 tisíc párů bází. To neumožňuje použití standardních metod k oddělení DNA těchto plazmidů od DNA nukleoidu, což vytváří určité potíže při práci molekulárních biologů s plazmidy.

Jaké geny nesou plazmidy Ti? Pro infekci rostlin je nejdůležitější oblast Vir (z angl. virulence – schopnost infikovat [rostliny], patogenita), ve které je zakódováno poměrně dost genů. Neustále pracují pouze dva geny: VirA a VirG. Protein VirA je receptor pro speciální látku fenolické povahy – acetosyringon. Acetosyringon se uvolňuje při poškození rostlinných buněk. Protein VirA reaguje na acetosyringon a předává signál proteinu VirG, který aktivuje všechny ostatní geny v oblasti Vir. V důsledku toho: 1) buňky agrobakterií plavou k místu léze (řízeno zvýšením koncentrace acetosyringonu); 2) Ti plazmid se začne množit a přenášet na jiné bakterie stejného druhu; 3) objevují se další proteinové produkty genů oblasti Vir (obr. 2).

Obr. 2. Funkce některých proteinů z oblasti Vir. Obrázek: „Potenciál. Chemie. Biologie. Lék”

Protein VirD1 spolu s proteinem VirD2 nalézají určité úseky v Ti-plazmidu, sestávající z 25 nukleotidových párů, a štěpí je a přenášejí kovalentní vazbu z konce DNA na protein VirD2. U Agrobacterium tumefaciens Existují dvě takové oblasti: omezují takzvaný T-region (z angl. přestoupil – přenosný). Jeden z řetězců DNA se oddělí a opustí; tak se v Ti plazmidu objeví mezera. Speciální systém opravy DNA vyplní mezeru novým řetězcem DNA a ze stejného Ti-plazmidu lze znovu vyříznout T-oblast; Ti-plazmid jako celek je zachován.

ČTĚTE VÍCE
Co mohu udělat, abych zabránil kondenzaci vlhkosti na balkóně?

Jednovláknová T-DNA spojená s proteinem VirD2 je následně „oblečena“ pomocí proteinu VirE2, který brání enzymovým systémům bakteriální buňky zničit jednovláknovou T-DNA.

Na povrchu buňky Agrobacterium se pomocí různých proteinů VirB vytváří aparát pro přenos DNA z jedné buňky do druhé. Jsou to proteiny VirB, které jsou zodpovědné za pohyb komplexu VirD2 s jednovláknovou DNA z buňky Agrobacterium do rostlinné buňky. VirE2 proteiny se také translokují do hostitelské buňky.

Dále komplex jednovláknové T-DNA s proteiny VirD2 a VirE2 proniká do jádra rostlinné buňky. Protein VirD2 „rozřízne“ DNA hostitelské buňky a vloží T-DNA z Ti plazmidu. Dochází tak k procesu vkládání cizí DNA do DNA rostlinné buňky. Poté může být rostlinná buňka považována za geneticky modifikovanou. V procesu evoluce si agrobakterie „vyvinuly“ mechanismus pro produkci geneticky modifikovaných rostlinných buněk, tj. staly se přirozenými „genetickými inženýry“.

Co je obsaženo v T-regionu

Geny obsažené v oblasti T nefungují v samotné buňce Agrobacterium, protože mají pouze eukaryotické promotory. Dva z těchto genů jsou zodpovědné za biosyntézu auxinu: to joRuka to joM. Další gen – IptZ – kóduje klíčový enzym pro syntézu isopentenyladeninu (jedna z forem cytokininů). Jakmile je tedy T-DNA v rostlinném genomu, způsobí syntézu jak auxinů, tak cytokininů (obr. 3). V tomto případě se buňky hostitelské rostliny začnou neorganizovaně dělit a tvoří nádor.

Obr. 3. Po vložení T-oblasti začíná v buňce hostitelské rostliny nekontrolovaná syntéza auxinů, cytokininů a opinů. Obrázek: „Potenciál. Chemie. Biologie. Lék”

Aby však dělení rostlinných buněk prospělo agrobakteriím, je nutné, aby syntetizovaly něco užitečného pro agrobakterie. T-oblast skutečně zahrnuje geny pro biosyntézu látek, které se tvoří z aminokyselin a keto sloučenin. Tyto látky se nazývají opiny. Ani samotné rostliny, ani jiné organismy žijící na rostlinách nemohou opin rozkládat. A pouze agrobakterie jsou schopny „strávit“ opin, jehož syntézu způsobily.

Opinů je poměrně hodně a každý Ti-plazmid zajišťuje syntézu vlastního opinu (nopalin, agrocinopin, vitopin, kurkumopin atd.). V samotném Ti-plazmidu (ale ne v T-oblasti!) jsou geny zodpovědné za „trávení“ odpovídajícího opinu. To vysvětluje, proč jeden Ti plazmid, který zachytil buňku Agrobacterium, nevpustí do něj jiný Ti plazmid, který je zodpovědný za syntézu a metabolismus jiného opinu.

ČTĚTE VÍCE
Mohu po kapkách nosit obojek proti blechám?

Po zavedení DNA z T-oblasti se nádorové buňky rychle dělí a produkují přesně ten opin, který je schopen „strávit“ agrobakterium, které způsobilo infekci. Pokud v půdě žijí dva různé typy agrobakterií, pak během infekce první bakterie nějakým způsobem brání vstupu druhé, která se živí jiným opinem.

To je základem biologické metody boje proti agrobakteriální rakovině. Jak víte, existují nepatogenní agrobakterie. Také „nedovolí“ jiným druhům agrobakterií dosáhnout kořenového systému rostliny, přes které dochází k poškození. Pokud rostlinu předem ošetříte určitými kmeny A. radiobacter, pak se u rostliny nevyvine žluč v koruně, rakovina kořenů nebo vousaté kořenové onemocnění.

Překvapivě některé agrobakterie nemají ve svých plazmidech jednu, ale dvě nebo dokonce tři T-oblasti, z nichž každá je „rámována“ sekvencemi 25 nukleotidů. Když A. rhizogenes tyto oblasti se nazývají TL a TR-okresy a A. rubi je tam TA, TB a TC respektive. Nejpřekvapivější chorobou je vousatý (střapatý) kořen. V TR-region obsahuje stejné geny jako ostatní agrobakterie. Jsou zodpovědné za syntézu auxinů, cytokininů a opinů. V TL-region obsahuje geny zodpovědné za přeměnu neaktivních forem auxinů na aktivní. Ukazuje se, že k úspěšné infekci stačí pouze TL-okres! A pak nádorové buňky aktivují „rezervní“ formy auxinů samotné rostliny a to vede k rhizogenezi, tedy tvorbě četných adventivních kořenů v místě nádoru.

V důsledku přenosu T-DNA z Ti-plazmidu do buňky hostitelské rostliny tedy dochází k nekontrolované tvorbě hormonů (auxinů a cytokininů), což vede k růstu maligních buněk a další syntéze látek obsahujících dusík – opinů . Do místa nádoru proudí stále více aminokyselin, které jsou však neustále „odstraňovány z oběhu“ rostliny, protože se přeměňují na nové dávky opinů, které slouží jako zdroj výživy pro příslušný kmen agrobakterií. . Rostlinné buňky se již nemohou „zbavit“ cizí DNA. Růst buněk a syntéza opinů pokračují, i když agrobakterie z nějakého důvodu zemřou.

Získávání geneticky modifikovaných rostlin pomocí agrobakterií

Ukázalo se, že geny oblasti Vir přenášejí do rostlinné buňky jakékoli sekvence DNA, které jsou obsaženy mezi dvěma 25-nukleotidovými repeticemi. Geny z T-oblasti stále „nefungují“ v buňkách Agrobacterium. Proto mohou být agrobakterie „oklamány“: namísto „normálních“ genů mohou být do T-DNA zahrnuty ty geny, které člověk potřebuje. Pak bude fungovat celý infekční systém, ale do rostliny se dostanou úplně jiné geny!

ČTĚTE VÍCE
Je možné zasadit řízky břečťanu přímo do půdy?

Při realizaci tak zdánlivě jednoduchého nápadu se však objevily určité potíže. Tím hlavním je velikost Ti plazmidů, která neumožňuje jejich izolaci z buněk Agrobacterium. Poté se vědci rozhodli rozdělit Ti plazmid na dvě části: ponechat oblast Vir v jedné a oblast T v druhé (nyní malé). Plazmid s oblastí Vir se nazývá „helper“ (neboli helper, z angl. pomoc – pomoci).

Malý plazmid s umělou T-oblastí lze izolovat z bakteriálních buněk, „rozříznout/slepit“ pomocí speciálních enzymů ve zkumavkách, vložit požadované geny do T-oblasti a poté propagovat v E. coli (Escherichia coli) a přeneseny do agrobakterií.

Aby se zajistilo, že se žádný z plazmidů „neztratí“, byl každý vybaven geny pro odolnost vůči různým antibiotikům. Nyní, pěstováním bakterií na médiu s určitou kombinací antibiotik, je možné vybrat buňky, které přijaly buď jeden z plazmidů, nebo oba.

Problém praktické práce s Ti-plasmidem je tedy vyřešen. Jak ale můžete zjistit, zda byla DNA přenesena z oblasti T? Nyní se totiž geny pro biosyntézu auxinů a cytokininů do buněk nedostanou a nemůže vzniknout nádor.

Kromě genu zájmu vědců (tzv. zájmového genu) se do T-oblasti nutně vkládá gen pro rezistenci na nějaké třetí antibiotikum, které působí na rostlinné buňky. Kromě živin se do média přidávají auxin a cytokinin a také antibiotika v nové kombinaci: tak, aby agrobakterie a rostlinné buňky bez vložené T-oblasti zemřely a geneticky modifikované buňky přežily. Jak si pamatujete, auxin a cytokinin jsou potřebné pro dělení rostlinných buněk. V důsledku toho by měla růst kalusová hmota z geneticky modifikovaných buněk. Stejnými biotechnologickými metodami z něj lze získat nové rostliny (viz „Potenciál“ č. 10).

Obr. 4. Glukuronidázový reportérový gen nám umožňuje pomocí modré barevné reakce určit, že rostlina je geneticky modifikovaná. Foto z www.phys.ufl.edu

Ve všech fázích práce by bylo dobré přesně vidět, do kterých buněk se umělá T-DNA dostala. K tomu je do T-oblasti zaveden další gen – reportér. Hlavním požadavkem na to je, aby se genový produkt nenacházel v běžných rostlinných buňkách a měl být snadno a rychle detekován. Dnes se jako reportéry nejčastěji používají dva geny: glukuronidáza (z bakterií) a zelený fluorescenční protein (z medúz). Glukuronidáza dává barevnou reakci se syntetickou látkou, při které se geneticky modifikované buňky zbarví do tmavě modré (obr. 4). Existuje pouze jedna nevýhoda: buňky tímto barvením umírají. Zeleně fluorescenční protein svítí při osvětlení světlem o určité vlnové délce a buňky neumírají (obr. 5).

ČTĚTE VÍCE
Jaké plodiny lze pěstovat na jednom záhonu?

Obr. 5. Zelený fluorescenční protein jako reportér umožňuje pozorovat živé buňky v rostlinách. Fotografie z www.genomenewsnetwork.org

A teprve v posledních fázích kontrolují, zda sledovaný gen funguje (zpravidla je nutné provádět četné testy na přítomnost určitých sekvencí DNA a RNA a na proteinový produkt samotného genu zájmu).

V každé geneticky modifikované rostlině se tedy kromě genu zájmu nachází „balast“ nebo „genetické zbytky“, reprezentované alespoň reportérovým genem a genem rezistence.

Pomocí různých triků se zájmovým genem je možné získat rostliny obsahující nový proteinový produkt, který se dříve v rostlinných buňkách nevyskytoval. Nebo naopak můžete „vypnout“ některé vlastní geny rostliny, „přimět“ je pracovat v jiných orgánech a tkáních atd. To umožňuje vědcům podrobně studovat práci rostlinného genomu. Ale geneticky modifikované rostliny mají také praktické využití.